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神經(jīng)干細胞（NSCs）因具備獨-特的增殖能力與多向分化潛能，在神經(jīng)科學研究中發(fā)揮著重要作用。然而，在培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的過程中，科研人員常常會遇到培養(yǎng)要求高、分化控制難等挑戰(zhàn)。
那么，如何選擇合適的培養(yǎng)方式？不同培養(yǎng)條件對細胞狀態(tài)有何影響？本文將深入介紹和解析神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法、誘導分化策略，并為您解答常見實驗難題，助力您的研究更進一步！
神經(jīng)干細胞的基本介紹
神經(jīng)干細胞可以從不同的組織中分離獲得，常見的來源有胚胎、大腦皮層、海馬體和脊髓等。為了在體外成功培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，合適的培養(yǎng)體系至關(guān)重要，培養(yǎng)基的成分、添加劑的使用、培養(yǎng)條件等因素都對神經(jīng)干細胞的增殖、存活以及分化狀態(tài)有著深遠的影響。
生長培養(yǎng)基
常用配方：DMEM/F12 + B-27（不含維生素A）+ bFGF + EGF + 雙抗
為更好地滿足神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)需求，普諾賽®提供經(jīng)過配方優(yōu)化的神經(jīng)干細胞完-全培養(yǎng)基，助力您的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)工作更加高效、穩(wěn)定。
培養(yǎng)條件
氣相：空氣，95%；CO2，5%
溫度：37℃
神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法
神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法主要分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩大類，這兩種方法各具特色，適用于不同的研究需求。
懸浮培養(yǎng)
通過使用未經(jīng)TC（Tissue Culture）處理、未包被或低吸附的培養(yǎng)器皿和無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，自然形成神經(jīng)干細胞球。
貼壁培養(yǎng)
通過將神經(jīng)干細胞球消化分散成單個細胞后，接種在經(jīng)TC處理和包被的培養(yǎng)器皿內(nèi)，用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，形成貼壁生長的單層細胞。
懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)優(yōu)缺點
懸浮培養(yǎng)
優(yōu)點 | 缺點 |
可以形成穩(wěn)定的神經(jīng)球，保持未分化狀態(tài)，有利于長期培養(yǎng)和大規(guī)模擴增 | 易形成大細胞球，中心細胞易缺氧、缺營養(yǎng)死亡 |
懸浮培養(yǎng)早期增殖速率優(yōu)于貼壁培養(yǎng) | 懸浮培養(yǎng)自噬體形成增多，可能因為神經(jīng)球內(nèi)細胞營養(yǎng)缺乏而激活自噬 |
培養(yǎng)條件和方法簡單，分離培養(yǎng)成功率高，離心或半量換液操作簡單 | 需要頻繁離心和重懸細胞，增加細胞損失 |
干性維持能力更強，相比貼壁培養(yǎng)不易分化 | 不利于誘導分化和分化形態(tài)觀察 |
貼壁培養(yǎng)
優(yōu)點 | 缺點 |
能形成形態(tài)規(guī)則的單層細胞，傳代損耗低，容易觀察到細胞形態(tài)和分化階段，更有助于神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)和存儲 | 長期培養(yǎng)易自發(fā)分化 |
貼壁培養(yǎng)的單層NSCs，與培養(yǎng)基接觸面更大，誘導分化成功率更高 | |
貼壁培養(yǎng)的NSCs經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后仍可保持較強的增殖能力，同時具有多分化潛能的特性 | NSCs貼壁不牢，易脫落，需使用TC處理和包被的培養(yǎng)器皿；細胞傳代操作復(fù)雜，傳代后易再次懸浮成球 |
貼壁培養(yǎng)的NSCs自噬水平較低，有利于維持細胞的穩(wěn)定性和增殖能力 |
神經(jīng)干細胞的誘導分化
1）誘導分化為星形膠質(zhì)細胞
將神經(jīng)干細胞球體消化分散后離心，使用星形膠質(zhì)細胞誘導培養(yǎng)基（DMEM高糖＋B-27，含維生素A＋N-2＋GlutaMAX＋FBS＋bFGF[1]）重懸細胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。隨著誘導分化的進行，神經(jīng)干細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾切文z質(zhì)細胞，其形態(tài)變化如圖1所示。
圖1. 神經(jīng)干細胞誘導分化為星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化
2）誘導分化為少突膠質(zhì)細胞
與星形膠質(zhì)細胞誘導方法類似，使用少突膠質(zhì)細胞誘導培養(yǎng)基（DMEM/F12＋B-27，含維生素A＋EGF＋bFGF＋T3＋胰島素[2]）誘導神經(jīng)干細胞分化為少突膠質(zhì)細胞，其形態(tài)變化如圖2所示。
圖2. 神經(jīng)干細胞誘導分化為少突膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化
3）誘導分化為神經(jīng)元細胞
將神經(jīng)干細胞球體消化分散后離心，使用神經(jīng)元細胞誘導培養(yǎng)基（Neurobasal神經(jīng)元培養(yǎng)基+1% N-2+2% B-27含維生素A+NEAA+β巰基乙醇+L-谷氨酰胺）重懸細胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，在神經(jīng)元細胞誘導培養(yǎng)基中加入10 ng/mL GDNF和10 ng/mL BDNF，以進一步促進神經(jīng)元的分化[3]。
神經(jīng)干細胞培養(yǎng)常見問題解答
1）
如何準確判斷神經(jīng)干細胞的傳代時機？
神經(jīng)干細胞傳代時機需根據(jù)神經(jīng)干細胞球的大小和形態(tài)判斷。應(yīng)讓神經(jīng)干細胞球中間保持明亮，避免細胞球生長過大。如圖3所示，右下角神經(jīng)干細胞球體過大，球中部發(fā)暗，應(yīng)該在這種狀態(tài)出現(xiàn)之前進行傳代。一般而言，神經(jīng)干細胞進行1:2傳代后，大約2-3天可再次傳代。
圖3. 神經(jīng)干細胞球生長形態(tài)
2）
神經(jīng)干細胞較難消化成單個細胞，是否必須完-全消化？
在懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時，無需將神經(jīng)干細胞球徹-底消化至單個細胞狀態(tài)。而貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時，需將其消化分散成單個細胞，這樣更利于細胞的貼壁生長（如圖4）。在此過程中，推薦使用Accutase酶，相較于常用的胰酶，Accutase酶消化作用更為溫和，能夠顯著降低對細胞的損傷風險。
圖4. 使用Accutase酶消化成單細胞接種圖
3）
懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，如何進行換液？
建議采用半量換液法進行操作，具體操作步驟如下：將培養(yǎng)瓶豎直靜置，待大部分細胞自然沉降后，吸棄原培養(yǎng)體積一半的細胞培養(yǎng)上清液，補加等體積新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。為減少細胞損失，可將培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至離心管中，使用離心機500 rpm離心5 min后，棄去上清，用等體積新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
無論是懸浮培養(yǎng)還是貼壁培養(yǎng)，都各有優(yōu)缺點，科研人員可根據(jù)實驗需求選擇合適的方法。此外，掌握正確的誘導分化策略和優(yōu)化培養(yǎng)條件，能夠有效提升神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)成功率。
希望本篇指南能為您的實驗提供實用參考，如有更多疑問，歡迎留言交流！更多細胞培養(yǎng)干貨，請持續(xù)關(guān)注細胞學堂專欄~
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參考文獻
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Sardar D, Lozzi B, Woo J, et al. Mapping Astrocyte Transcriptional Signatures in Response to Neuroactive Compounds[J]. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(8):3975.
[2]
楊慧敏. 新生大鼠神經(jīng)干細胞定向分化為少突膠質(zhì)細胞的實驗研究[D]. 重慶醫(yī)科大學, 2006.
[3]
李登賀. 神經(jīng)干細胞定向分化為中間神經(jīng)元的研究[D]. 昆明理工大學, 2016.
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